类器官培养过程中最常遇到的问题莫过于类器官长不起来，后续实验无法开展，常常让一些实验小白焦头烂额，你是否也正在面临这样的困境呢？今天我们就来捋一捋，看看类器官长不起来的难题究竟该从哪些方面入手进行化解。
类器官培养失败，原因无非有三：细胞状态不对，培养体系不合适，实验操作有问题。接下来我们将从以下三方面入手，将类器官培养过程中出现的问题逐个击破。
类器官来源细胞
原因：
起始的多能干细胞（hPSC）质量低，可能导致类器官形成效率低；不同种类的类器官活性差异很大，有些类器官本身活性不足，比如甲状腺癌类器官，只能维持原代，传代后基本不长。除此以外，公认难养的类器官还有肝癌类器官、前列腺癌类器官。
解决方法：
去除自发分化的细胞，确保接种高质量、未分化的hPSC；对于无法传代或者传代困难的类器官，尽量用原代细胞进行实验或者寻找其他替代方案。
原因：
培养皿表面涂层的种类和质量可能会影响细胞附着的方式。某些涂层可能粘附性过强，导致细胞无法形成3D结构；细胞密度过高、悬浮状态不良等因素也可能阻碍细胞形成3D结构，使其更倾向于贴壁生长。
解决方法：
选择适合类器官培养的培养皿和涂层，使用支架、基质或微流控设备，提供适当的微环境，减少细胞贴壁的倾向；通过测试不同的接种密度，确定最佳的细胞接种密度，避免因细胞密度过高而影响悬浮状态。
原因：
细胞或组织样本可能被污染，从而影响类器官的形成。
解决方法：
确保无菌操作，避免室内空气中的气流和粒子（灰尘和孢子）污染；使用经过灭菌处理的试剂和耗材；定期维护培养箱、生物安全柜等仪器设备。
类器官中的真菌污染
类器官培养体系
原因：
培养基和生长因子使用不当，可能导致类器官培养失败。
解决方法：
确保使用高质量的培养基和生长因子；操作时要小心、快速，注意预冷，避免基质胶因为温度过高而成胶；根据文献资料和实验目的选择合适的培养基和生长因子；培养基和生长因子不宜储存过久，开封后应尽快使用（有的类器官对培养体系较为敏感，不新鲜的培养体系会影响类器官生长状态）。
原因：
消化液对类器官传代的影响主要体现在两个方面：传代消化液是否恰当，不合适的酶会造成类器官损伤；放置过久或保存不当的消化液，酶活会逐渐下降，消化类器官需要增加时间，容易导致消化过度，从而使类器官活性受损。
解决方法：
选择合适的类器官消化液；对消化液进行适当保存，必要时进行分装。
原因：
基质胶的作用有两个，其一是起支架作用，维持类器官的3D形态，其二是含有丰富的因子种类，对类器官的生长有促进作用。当基质胶在4℃储存时间过久，基质胶的粘附性和因子活性均会大大降低，此时的基质胶类器官穹顶结构容易脱离培养板底面而漂浮，同时也难以维持类器官增殖需求。
解决方法：
初次使用时注意分装，所有分装均需用预冷的冻存管，迅速分装并保存，避免多次冻融。避免在4℃储存过久。
实验操作问题
原因：
类器官在培养孔中分布不均，影响实验结果的均一性和可重复性。
解决方法：
接种之前，确保使用多通道移液器上下吹打多次，产生均匀的单细胞悬液。小心将悬液注入孔板中。
原因：
离心条件不当可能会对类器官造成损伤。离心过程中产生的机械应力可能会对类器官细胞造成破坏，这种损伤包括细胞膜的破裂、细胞内部结构的损伤，以及细胞功能的丧失；离心时的温度对类器官的保存状态有重要影响，离心温度过高可能会导致基质胶固化，影响类器官的分离和保存。
解决方法：
建议在4℃的低温条件下进行离心，以避免热损伤。基质胶冷化后在进行离心分层时，建议选用水平角离心机，转速控制200g-300g，温度设为4℃，时长控制在5分钟以内。
原因：
离心后的类器官通常分为三层：缓冲液、基质胶、类器官沉淀，正常是保留类器官沉淀层，上面的缓冲液和基质胶弃掉。但如果类器官数量很少，分层后的类器官沉淀层也会很少，只留下最下层的类器官沉淀，容易损失部分原代类器官，导致后期生长速度减慢。
解决方法：
建议同时保留类器官沉淀和基质胶的下2/3，以减少类器官的损失（基质胶层会残留类器官）。
原因：
枪头吹打容易对细胞造成机械损伤；吹打力度过大会导致培养基中有气泡产生，细胞处在气泡与培养基之间，当气泡破碎时，细胞瞬间会受到剪切力影响从而导致细胞碎裂。这些都会影响到后续类器官的生长状态。
解决方法：
为了减少这部分损伤，需要尽量减小吹打力度，只要保证能够吹下吹散细胞就行。枪头与细胞层接触甚至研磨会导致细胞直接死亡，因此在操作时需要控制枪头与培养板底的间距，避免直接接触；轻柔操作，避免力度过大产生气泡。
综上，只要严格把控好类器官细胞状态、选好培养体系、规范实验操作，类器官培养将不再成为你攀登科研高峰的阻碍。
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