脊椎动物胚胎轴体的形成从胚胎尾部的祖细胞群开始。其中，神经中胚层祖细胞（NMP）具备向外胚层发育为神经板及神经管，以及向中胚层发育为脊索和轴旁中胚层（PXM）等的能力。PXM随后发育为体节（somite），体节进一步分化为生骨节、生皮节和生肌节，未来成为脊椎（图1）[1]。神经管、脊索和体节是躯干组织的主要部分。尤其是位于胚胎中线的脊索，是轴体形成的标志性结构，为发育中的胚胎提供结构支持，并通过信号分子调控周围组织发育。
图1：中胚层发育模式
（来源：参考资料[1]）
尽管此前已使用干细胞开发了模拟原肠胚、体节等结构及功能的类器官，然而最关键的脊索及其依赖组织，如神经底板的体外模型一直未能成功构建。直至2024年12月18日，英国 Francis Crick Institute团队在顶刊Nature上发表了题为“Timely TGFβ signalling inhibition induces notochord”的研究论文，首次通过WNT和FGF激活以及延迟24小时后的TGFβ/BMP抑制，成功诱导了脊索类器官notoroids的建立。该方法可稳健构建由体节和神经周围组织包覆的脊索细胞，且产生的脊索类器官具有体外调控神经管及体节发育的能力。
（来源：参考资料[2]）
01 躯干组织主要祖细胞群体特征
鸡胚尾部区域的scRNA-seq聚类分析揭示，在4体节到13体节的发育阶段，对脊椎动物躯干形成负责的主要祖细胞群体为NMP和脊索祖细胞。其中，NMP共表达神经细胞标志物SOX2与中胚层标志物TBXT（即SOX2+TBXT+细胞）。脊索祖细胞则具有表达高水平TBXT、FOXA2、SHH等的重点特征。
以上鸡胚检测结果与小鼠和猕猴中的检测结果几乎相同，证明脊椎动物躯干发育存在保守性。
图2：鸡躯干发育的单细胞转录组学分析
（来源：参考资料[2]）
02 诱导中胚层发育和脊索形成的主要信号通路
为了测试特定信号通路在躯干祖细胞特化中的功能，研究人员建立了SOX2+TBXT+NMP的躯干祖细胞体外模型，并通过几何限制诱导了有序的基因表达，以及脊索细胞、神经细胞等的分区排列。其中，SOX2高水平表达（SOX2hi）的类神经细胞位于克隆中心，而TBXT高水平表达（TBXThi）的类中胚层细胞位于克隆边缘位置。
WNT及FGF共刺激
此前已有多项研究证明，FGF和WNT信号诱导中胚层发育及PXM命运。本文中，FGF通路下游配体pERK1/2激活了克隆边缘TBXT标记的中胚层的发育，但对克隆中心SOX2标记的神经细胞影响较弱，且内源性FGF信号传导不足以驱动PXM形成。WNT则通过激活TBXT在NMP中诱导中胚层的形成。
有趣的是，WNT也与FGF协同促进pERK1/2表达及脊索形成，而TBXT的表达也依赖于FGF信号传导。总之，WNT和FGF关系密切，其共刺激对于脊索的形成是必要的。
图3：WNT及FGF诱导中胚层发育
（来源：参考资料[2]）
BMP延迟抑制
通过scRNA-seq，研究人员发现，NMP具有BMP和NODAL抑制剂BAMBI的高表达。脊索细胞中，也存在高水平BMP拮抗因子NOG和CHRD的表达。跨物种转录组比较进一步揭示了BMP和NODAL抑制在脊索中广泛的存在。其中，NODAL隶属转化生长因子β（TGFβ）信号家族。这些信息可能提示，TGFβ/BMP抑制也是脊索发育所必需。
研究人员进一步探索发现，根据TGFβ/BMP抑制的干预时间不同，可以诱导不同的细胞命运。瞬时TGFβ信号传导（短期抑制，从添加WNT和FGF后起24h后再进行抑制），导致SOX2+TBXT+NMP显著减少，细胞多向TBXT+FOXA2+脊索细胞命运转变。而延长的信号传导（长期抑制，延迟48h施加抑制）则诱导内胚层和侧板中胚层的产生。
图4：不同延迟处理下细胞类型标志物的免疫荧光。左侧为从添加WNT&TFG后起算到加入TGFβ抑制的时间。
（来源：参考资料[2]）
03 脊索类器官构建方案
综合以上研究结果，本研究采用人ES细胞，添加WNT&FGF共刺激，24h后给予TGFβ抑制，而后在添加视黄酸前体的条件下继续培养4天，最终成功获得脊索类器官（notoroids）。该模型内部细胞表达TBXT，指向脊索身份。外细胞层为SOX2+TBXT-，形态类似于神经上皮。脊索类器官可模拟胚胎尾部神经形成阶段，为躯干组织形成及发育研究提供了良好平台。
图5：脊索类器官的建立与验证
（来源：参考资料[2]）
04 引导周围组织命运
SHH是一类形态发生素，高浓度的SHH诱导腹部神经元的形成，低浓度的SHH则诱导运动神经元等的形成。scRNA-seq结果显示，脊索类器官产生的形态发生素SHH诱导了神经管向腹部神经元方向分化。此外，多种侧腹细胞类型的基因表达皆与附近脊索样细胞的存在相关。
新生PXM和脊索共表达BMP拮抗剂NOG和CHRD，从而保护并促进体节的形成与分化。scRNA-seq分析显示，脊髓类器官体外发育过程中出现类似于生骨节命运的基因表达模式，再度证明了脊索类器官对周围组织命运的调控能力。
05 总结
本文中，研究人员发现，WNT及FGF刺激以及BMP和NODAL抑制对于产生和维持躯干祖细胞和后部身份至关重要。事实上，WNT和FGF信号可诱导内源性NODAL和BMP的连续产生，以此促进内胚层和侧中胚层分化，这可能是此前使用CHIR和FGF产生3D类原肠胚方案含有大量内胚层的主因。本研究中，研究人员使用信号级联反应扩展当前早期人类发育3D模型，并获得了可形成脊索的体外躯干组织研究新平台，为脊椎动物躯干发育机制提供了全新见解与模型基础。
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参考资料
1.Tani, Shoichiro et al. “Understanding paraxial mesoderm development and sclerotome specification for skeletal repair.” Experimental & molecular medicine vol. 52,8 (2020): 1166-1177. doi:10.1038/s12276-020-0482-1
2.Rito, Tiago et al. “Timely TGFβ signalling inhibition induces notochord.” Nature, 10.1038/s41586-024-08332-w. 18 Dec. 2024, doi:10.1038/s41586-024-08332-w